1966年11月，格瓦拉化装成一位秃顶、戴眼镜的乌拉圭商人，从蒙得维的亚经巴西圣保罗市乘飞机抵达玻利维亚首都拉巴斯。他声称是美洲国家组织的特使，要从事社会调查工作，乘车抵达了尼阿卡瓦苏。他在这里准备训练一批游击队员，然后展开游击活动。但是由于他的活动没有得到玻利维亚共产党的支持，因而难以招募到玻利维亚人。游击队经初步训练后外出行军时，很快就被政府军队发现和包围。于是，游击队过早地暴露了自己，不得不与政府军队展开艰苦的周旋和战斗，1967年8月，由于叛徒的告密，游击队的秘密仓库被搜获，城市中的联络网也遭到破坏，游击队的处境从此更加困难。格瓦拉率军左冲右突。始终不能改变局势，加上伤病员增加，不得不兵分两路，进行突围。8月31日，以华金为首的一路游击战士在横渡马西库里河时，遭到敌人伏击，全部壮烈牺牲。格瓦拉率领的十六名游击队员被围于尤罗峡谷。10月8日下午1时，游击队滑下峡谷准备突围。但敌人的包围圈已经密合，随着密集的机枪声，格瓦拉腿部中弹受伤。当他包扎伤口时，敌人已出现在他面前。格瓦拉镇静地报出了自己的名字。敌人立即将他押送到附近的拉伊格拉村。敌军总部立即用直升飞机派来了高级军官和美国中央情报局的特务。次日黎明，敌人的军区司令等大小头目乘直升飞机到达，以便确认被俘者是否真是格瓦拉，并对格瓦拉进行审讯。格瓦拉临危不惧，坚定地回答敌人：“革命是永垂不朽的。”敌人见无法使他屈服，经请示玻利维亚总统和美国驻玻使馆同意，于10月9日下午杀害了格瓦拉。
1967年10月15日，古巴当局证实了格瓦拉罹难的消息，并将10月15日定为“游击队员日”。10月18日，古巴群众在革命广场悼念格瓦拉。古巴共产党中央委员会第一书记和革命政府总理菲德尔-卡斯特罗致悼词，高度评价了格瓦拉的一生，称他是“一个无与伦比的战士”、“一个无与伦比的领导人”。
